Vorkommen von DNA der Haupttypen onkogener Viren in der Struktur von Plattenepithelkarzinom und normaler Schleimhaut der Mundhöhle
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Der Originalartikel ist in RU Sprache (Link zum Lesen) geschrieben.
Zusammenfassung
Relevanz. Die Inzidenz von bösartigen Neubildungen der Schleimhaut der Mundhöhle und vor allem die Sterblichkeit durch diese Pathologie bleiben in Russland weiterhin auf einem signifikanten Niveau. In diesem Zusammenhang ist die Suche nach informativen prognostischen und prädiktiven Faktoren eine aktuelle Aufgabe für Fachleute, die sich mit der Behandlung von Tumoren der Schleimhaut der Mundhöhle beschäftigen.
Ziel. Bestimmung der Häufigkeit der Erkennung von DNA onkogener Viren in normaler Schleimhaut und Herden von Plattenepithelkarzinom der Schleimhaut der Mundhöhle.
Materialien und Methoden. Es wurde eine prospektive Studie durchgeführt, an der 50 gesunde Freiwillige und 116 Patienten mit erstmals verifiziertem Plattenepithelkarzinom der Schleimhaut der Mundhöhle teilnahmen. Bei allen Untersuchten wurde die DNA von HSV Typ I, II, CMV, EBV, HPV-Typen 6, 11, 16 und 18 mittels Echtzeit-PCR nachgewiesen.
Ergebnisse. Es wurde eine signifikant geringere Häufigkeit von HPV-DNA Typ 18 bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom im Vergleich zur normalen Schleimhaut festgestellt (HPV-18 wurde 2,8-mal seltener nachgewiesen (p < 0,0001)). In der Struktur des Plattenepithelkarzinoms und der normalen Schleimhaut der Mundhöhle wurde eine signifikant häufigere Assoziation der normalen Schleimhaut der Mundhöhle mit HPV-18 festgestellt, sowohl in Monoassoziation – 19 (18,0%) der Probanden in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Hauptgruppe – 6 (5,2%) (p=0,008), als auch in Kombination mit dem Epstein-Barr-Virus: 7 (14,0%) (Kontrollgruppe) im Vergleich zu 5 (4,3%) (Hauptgruppe) (p = 0,03). Auch signifikante Unterschiede wurden bei der Analyse der Kombination von HPV-18 mit dem Cytomegalovirus festgestellt, das nur in der Kontrollgruppe nachgewiesen wurde – 2 (4,0%) (p = 0,03).
Schlussfolgerung. Die durchgeführte Analyse lässt vermuten, dass das Vorhandensein von HPV-DNA, Typ 18, in den Zellen des Plattenepithelkarzinoms der Mundschleimhaut ein Faktor für einen günstigen Verlauf der Erkrankung sein könnte.
Die Inzidenz von bösartigen Neubildungen der Schleimhaut der Mundhöhle und vor allem die Sterblichkeit aufgrund dieser Pathologie bleiben sowohl weltweit als auch in Russland auf einem signifikanten Niveau. Laut den Daten des MNIIOI benannt nach P.A. Herzena (Zweigstelle des FGBU „NMIC für Radiologie“ des Gesundheitsministeriums Russlands) nähert sich die jährliche Sterblichkeit aufgrund dieser Pathologie (laut den Daten von 2017) 50% aller erstmals diagnostizierten Fälle der Erkrankung. Die morphologische Bildung des Herdes von Plattenepithelkarzinom der Schleimhaut der Mundhöhle ist ein komplexer, mehrstufiger Prozess, und die grundlegenden ätiologischen Faktoren für seine Entwicklung sind Tabakkonsum, Alkoholmissbrauch und unzureichende Mundhygiene, die sich nachteilig auf die Struktur der normalen Schleimhaut auswirken, insbesondere bei Personen mit genetischer Prädisposition zur Entwicklung von Onkopathologien. Neben den allgemein bekannten Risikofaktoren für das Auftreten von Plattenepithelkarzinom der Schleimhaut der Mundhöhle und registrierten präkanzerösen Erkrankungen gibt es eine Reihe von Faktoren, wie Virusinfektionen und Entzündungen, die möglicherweise ein wichtiges Glied im Pathogenese bösartiger Erkrankungen darstellen und die Entwicklung von 15-20% bösartigen Neubildungen potenzieren können.
Ziel der Studie
Bestimmung der Häufigkeit des Nachweises von DNA der Herpes-simplex-Viren Typ I und II (HSV-I, II), Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr-Virus (EBV) und Humanpapillomviren der Typen 6, 11, 16 und 18 (HPV-6, 11, HPV-16, HPV-18) in normaler Schleimhaut der Mundhöhle und in Herden von Plattenepithelkarzinom der Schleimhaut der Mundhöhle.
Materialien und Methoden der Studie
Um das gesetzte Ziel zu erreichen, wurde eine prospektive Studie durchgeführt, an der 50 gesunde Freiwillige (Kontrollgruppe) teilnahmen, die sich in der Zeit von 2012 bis 2013 in der klinischen Überwachung der Klinik für Kiefer-Gesichtschirurgie und Plastische Chirurgie der GBOU VPO Sankt-Petersburg Staatliche Medizinische Universität benannt nach Akademiker I.P. Pawlow befanden, sowie 116 Patienten (Hauptgruppe), bei denen erstmals die Diagnose „Plattenepithelkarzinom der Schleimhaut der Mundhöhle“ im Sankt-Petersburg Stadtstaatlichen Gesundheitsdienst „Städtisches Klinisches Onkologisches Dispensar“ in der Zeit von 2012 bis 2013 verifiziert wurde. Der gesamte Beobachtungszeitraum dauerte bis zum 17.07.2019, nach dem eine endgültige Datenanalyse durchgeführt wurde.
Hauptkriterien für die Aufnahme von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundschleimhaut in die Studie:
Unterzeichnung des Formulars für die freiwillige informierte Zustimmung zur Teilnahme an der Studie.
Alter, über 18 Jahre.
Morphologische Verifizierung der Diagnose „Plattenepithelkarzinom der Mundschleimhaut“.
Hauptkriterien für den Ausschluss von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundschleimhaut aus der Studie:
Festgestellte Fernmetastasen des Plattenepithelkarzinoms der Mundschleimhaut.
Hauptkriterien für die Aufnahme in die Gruppe gesunder Freiwilliger:
Unterzeichnung des Formulars für die freiwillige informierte Zustimmung zur Teilnahme an der Studie.
Alter, über 18 Jahre.
Fehlen von zum Zeitpunkt der Aufnahme in die Studie registrierten Erkrankungen der Mundschleimhaut entzündlicher, tumoröser oder anderer Art.
Hauptkriterien für den Ausschluss aus der Gruppe der gesunden Freiwilligen:
Histologische Verifizierung der Diagnose „Plattenepithelkarzinom der Schleimhaut der Mundhöhle“.
Allgemeine Charakteristik der Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Schleimhaut der Mundhöhle.
In der Hauptgruppe waren 77 Männer (66,38 %) und 39 Frauen (33,62 %). Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 60,80 ± 0,96 Jahre (95 % CI 58,90-62,70).
Bei 49 (42,24 %) der Patienten war der primäre Tumorort im Bereich der vorderen und mittleren Drittel der Zunge lokalisiert, bei 32 (27,60 %) war die Schleimhaut des Bodens der Mundhöhle betroffen. Die Schleimhaut des alveolären Teils des Unterkiefers war bei 8 (6,90 %) der Patienten betroffen, die Wange bei 7 (6,03 %) der Patienten. Seltener waren der vordere Gaumenbogen und die Schleimhaut der Pterygomandibulären Falte betroffen – bei 3 (2,59 %) der Patienten, der alveoläre Fortsatz des Oberkiefers, der retromolare Bereich und der harte Gaumen – bei 2 (1,72 %) der Patienten, und der weiche Gaumen und die Unterlippe – bei 1 (0,86 %) der Patienten entsprechend.
Frühe Krankheitsstadien (0, I und II) wurden bei 24 (20,69%) Patienten diagnostiziert (1,72%, 5,17% und 13,80% jeweils). Bei 18 (15,52%) Patienten wurde das Stadium III der Erkrankung festgestellt, während mehr als die Hälfte der Patienten – 68 (58,62%) – sich bereits mit Stadium IVA primär vorstellten. Bei 6 (5,17%) Patienten wurde der primäre Tumor als inoperabel (T4b) oder die Beteiligung regionaler Lymphknoten überstieg 6 cm (N3) – Stadium IVB.
Die durchgeführte histologische Untersuchung ergab, dass bei 35 (30,17%) die Differenzierung des Tumors hoch war (G1), bei 34 (29,31%) moderat (GII), und bei 13 (11,21%) Patienten war der Differenzierungsgrad des Tumors niedrig (GIII). In einem Drittel der Fälle – 34 (29,31%) – konnte der Differenzierungsgrad nicht bestimmt werden.
In 51 (43,97%) Fällen wurden histologische Anzeichen einer Verhornung festgestellt, in 29 (25,00%) Fällen wies der Tumor keine Anzeichen einer Verhornung auf, in 5 (4,31%) wurde der Grad der Verhornung als teilweise bestimmt, und in 31 (26,72%) Proben wurde das Vorhandensein von Verhornung nicht bewertet.
Allgemeine Charakteristik gesunder Freiwilliger.
Die Gruppe der gesunden Freiwilligen bestand aus 30 (60,0%) Männern und 20 (40,0%) Frauen. Das Durchschnittsalter betrug 55,7 Jahre (95% CI 47,60-61,35).
34 (68,0%) der Befragten suchten eine Beratung zur dentalen Implantation, 12 (24,0%) der Befragten benötigten eine chirurgische Vorbereitung für die kieferorthopädische Behandlung und 4 (8,0%) der Befragten wurden bezüglich der Retention/Dystopie von Zähnen beraten. Die gebildeten Gruppen waren hinsichtlich der demografischen Merkmale – Geschlecht und Alter – vergleichbar.
Methodik zur Identifizierung von DNA-Viren mittels real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Die Materialentnahme erfolgte unter lokaler infiltrativer Anästhesie aus dem Primärtumor von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Schleimhaut der Mundhöhle und des Zahnfleisches des Ober- oder Unterkiefers gesunder Freiwilliger; die Probenahmegröße betrug 0,5 x 0,5 cm. Nach der Entnahme wurde die Probe in einer Lösung von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) fixiert und bei –25 °C eingefroren.
Die Identifizierung der viralen DNA erfolgte mittels der real-time Polymerase-Kettenreaktion (Labor für molekulare Diagnostik der GBOU VO PspbGMU benannt nach I.P. Pawlow). Für die qualitative Identifizierung der DNA wurden spezialisierte Diagnosetests gemäß den Anweisungen der Hersteller verwendet. Die Sensitivität der PCR-Methoden betrug standardmäßig 102 Genkopien pro Probe.
Methodik der statistischen Analyse.
Die Variablen, die die Merkmale widerspiegeln, wurden mit Hilfe der deskriptiven Statistik analysiert. Um die verwendeten deskriptiven Kategorien der quantitativen Variablen zu bestimmen, wurden sie auf Normalverteilung mit dem Shapiro-Wilk-Test geprüft. In allen Fällen unterlagen die erhaltenen Daten einer Normalverteilung, weshalb ihre Beschreibung mittels des Mittelwerts und des Standardfehlers (M ± m) erfolgte. Der Vergleich der Gruppen der Probanden hinsichtlich der Häufigkeit des Merkmals wurde unter Verwendung des z-Tests (unter Berücksichtigung der Yates-Korrektur für Kontinuität) durchgeführt. Alle Indikatoren wurden mit einem zweiseitigen 95%-Konfidenzintervall (KI) und einem zweiseitigen „p“-Wert berechnet. Die statistische Verarbeitung erfolgte mit Hilfe des Softwarepakets Statistica® (StatSoft, ver. 12.0) und MedCalc® (ver. 19.0.7).
Ergebnisse der Analyse der Häufigkeit des Nachweises von Virus-DNA mittels Echtzeit-PCR
Die durchgeführte Analyse ergab, dass die Häufigkeit des Fehlens von Virus-DNA in beiden Gruppen gleich war, bei 54 (46,6%) Patienten der Hauptgruppe wurde in der Tumorstruktur keine virale DNA nachgewiesen, während in der Kontrollgruppe bei 17 (34,0%) der Untersuchten virale DNA fehlte (p = 0,13). In der restlichen Kohorte der Untersuchten wurde signifikant häufiger die DNA des Epstein-Barr-Virus (EBV) nachgewiesen – bei 40 (34,48%) Patienten der Hauptgruppe (p < 0,0001) und 15 (30,00%) gesunden Freiwilligen (p = 0,03). Plattenepithelkarzinom der Schleimhaut der Mundhöhle war signifikant häufiger mit der DNA von humanen Papillomaviren assoziiert, sowohl insgesamt in 48 (41,4%) Fällen (p < 0,0001) als auch nach den betrachteten Subtypen: HPV-6,11 – 16 (13,8%) (p = 0,005), HPV-16 – 12 (10,3%) (p = 0,001), HPV-18 – 20 (17,2%) (p < 0,0001). In der Kontrollgruppe wurde die HPV-DNA signifikant häufiger nur insgesamt nachgewiesen – 27 (54,0%) (p < 0,0001), und bei HPV-18 – 24 (48,0%) (p < 0,0001).
Die durchgeführte vergleichende Analyse der Häufigkeit der Registrierung von viraler DNA in beiden Gruppen ergab die folgenden Ergebnisse, die in Tabelle 1 dargestellt sind.
Im Rahmen unserer Studie wurde eine signifikant häufigere Präsenz von HPV-18-DNA in den Zellen der Mundschleimhaut gesunder Freiwilliger im Vergleich zu Patienten mit Plattenepithelkarzinom festgestellt – in der Kontrollgruppe wurde HPV-18 2,8-mal häufiger nachgewiesen (p < 0,0001).
Es ist jedoch zu beachten, dass die DNA nur eines Virustyps in der Hauptgruppe nur bei einem Drittel der Patienten nachgewiesen wurde – 34 (29,3%), während in der Kontrollgruppe 19 (38,0%) der Untersuchten (p = 0,14) betroffen waren. Zwei Virustypen wurden ebenfalls gleich häufig sowohl in der Hauptgruppe – 24 (20,7%) – als auch in der Kontrollgruppe – 14 (28,0%) – registriert (p = 0,16). Eine Assoziation von drei oder vier Virustypen wurde nur bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundschleimhaut festgestellt – 3 (2,6%) und 1 (0,9%) (p = 0,26) (Tab. 2).
Die Ergebnisse der Unteranalyse von Virus-Kombinationen in der Struktur des Plattenepithelkarzinoms und der normalen Schleimhaut der Mundhöhle zeigten eine signifikant häufigere Assoziation der normalen Schleimhaut der Mundhöhle mit HPV-18, sowohl in der Monoassoziation – 19 (18,0%) der Probanden in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Hauptgruppe – 6 (5,2%) (p = 0,008), als auch in Kombination mit dem Epstein-Barr-Virus: 7 (14,0%) (Kontrollgruppe) im Vergleich zu 5 (4,3%) (Hauptgruppe), (p = 0,03). Auch signifikante Unterschiede wurden bei der Analyse der Kombination von HPV-18 mit dem Zytomegalovirus festgestellt, die nur in der Kontrollgruppe gefunden wurde – 2 (4,0%) (p = 0,03). Auf der anderen Seite wurde die Kombination von EBV mit HPV-16 nur bei 6 (5,2%) der Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundschleimhaut registriert, mit einer Tendenz zu einer häufigeren Auftretenshäufigkeit einer solchen Kombination (p = 0,1).
Diskussion
Unsere durchgeführte Analyse konnte signifikant zeigen, dass das Fehlen einer Assoziation der Mundschleimhaut sowohl in unveränderter Schleimhaut als auch in Herden des Plattenepithelkarzinoms gleich häufig vorkommt, was darauf hindeutet, dass die betrachteten Patienten vergleichbar sind.
Im Rahmen der Studie haben wir eine häufigere Nachweisrate von DNA des humanen Papillomavirus Typ 18 in der Struktur der normalen Schleimhaut der Mundhöhle registriert, sowohl in Monoassoziation als auch in Kombination von HPV-18 mit anderen Virustypen (EBV, CMV). Ähnliche Studien und vergleichbare Ergebnisse, hauptsächlich in Bezug auf HPV-18, wurden beispielsweise bereits von Yeudall W. A. und Campo M. S. (Vereinigtes Königreich) im Jahr 1991 erzielt: Mit Hilfe von PCR wurden 25 Proben normaler Schleimhaut der Mundhöhle analysiert, in denen in 8% der Fälle DNA von HPV-18 nachgewiesen werden konnte, während in der Struktur des Plattenepithelkarzinoms DNA von HPV-18 in 20,5% der Fälle von 39 Untersuchten nachgewiesen wurde. Die Daten in der Literatur sind jedoch uneinheitlich: Zum Beispiel analysierten Saghravanian N. und Co-Autoren (Iran) im Jahr 2011 18 Proben normaler Schleimhaut und 21 Proben von Plattenepithelkarzinomen der Mundschleimhaut und stellten fest, dass in der unveränderten Schleimhaut DNA von HPV-16 und HPV-18 in keiner Probe nachgewiesen werden konnte, während in den Herden des Plattenepithelkarzinoms 3 (14,3%) positive Analysen für diese Virustypen vorlagen. Im Jahr 2017 analysierten Liu T. und Co-Autoren (China) mit Hilfe von immunhistochemischen Analysen die Häufigkeit der Assoziation von 22 Proben normaler Schleimhaut der Mundhöhle und in 6 Proben von Plattenepithelkarzinomen mit HPV Typen 16 und 18, wobei die DNA der Viren in 62,5% der Fälle in der Gruppe gesunder Freiwilliger und bei allen 6 (100%) Patienten mit Onkopathologie nachgewiesen wurde. Die Ergebnisse unserer Studie zeigen signifikant, dass das Plattenepithelkarzinom der Mundschleimhaut häufiger mit der DNA von humanen Papillomaviren assoziiert ist, sowohl insgesamt in 41,4% (48) der Fälle als auch nach einzelnen Virustypen: HPV-6,11 – 13,8%, HPV-16 – 10,3%, HPV-18 – 17,2%, während in der normalen Schleimhaut DNA von HPV signifikant häufiger nur in der Gesamtheit – 54,0% und im Fall von HPV-18 Typ – 48,0% nachgewiesen wurde, im Vergleich zu anderen Subtypen, die deutlich seltener vorkamen.
Es gibt nur sehr wenige russische Studien zu dem behandelten Thema, man kann sagen, dass sie vereinzelt sind und die Anzahl der in diesen Studien untersuchten Personen gering ist. Eine der letzten Studien ist die Arbeit von Kirjanov S. A. und seinen Co-Autoren, die Ende 2019 veröffentlicht wurde: Die Autoren untersuchten 10 Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundschleimhaut auf das Vorhandensein von HPV- und EBV-DNA mittels Echtzeit-PCR und stellten fest, dass HPV-DNA in keiner der Tumorgewebeproben nachgewiesen werden konnte, während EBV-DNA in 7 (70,0%) Fällen nachgewiesen wurde. In unserer Studie wurde EBV-DNA nur bei 34,48% (40) der Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundschleimhaut und bei 30,00% (15) der gesunden Freiwilligen nachgewiesen.
Die Analyse der erhaltenen Daten lässt vermuten, dass der Nachweis von HPV-Typ 18 in den Zellen des Plattenepithelkarzinoms der Mundschleimhaut ein Faktor für einen günstigen Verlauf der Erkrankung sein könnte, und die Überlebensraten sowie die Wirksamkeit der onkologischen Behandlung in dieser Patientengruppe über den entsprechenden Werten von HPV-18-negativen Patienten liegen werden. Somit könnte unsere Studie mit einem signifikanten klinischen Material möglicherweise einen neuen Blick auf Viren als einen verlässlichen ätiologischen Faktor für die Entwicklung des Plattenepithelkarzinoms der Mundschleimhaut ermöglichen. Unserer Meinung nach sollte besonderes Augenmerk auf die Assoziation des Plattenepithelkarzinoms der Mundschleimhaut mit HPV-18 als wahrscheinlichem ätiologischen Faktor für die Entwicklung der malignen Degeneration der Strukturen der Mundschleimhaut gelegt werden. Es bedarf jedoch ohne Zweifel weiterer tiefgehender Untersuchungen zu diesem Thema, um die tatsächliche Rolle des viralen Faktors in der Entwicklung und dem Verlauf des Plattenepithelkarzinoms der Mundschleimhaut zu bestimmen.
Kutukova S.I., Chuchlovin A.B., Yaremenko A.I., Ivas'kova Yu.V., Razumova A.Y., Ermakova T.S.
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