Kontrastverstärkte Mikro-CT zur Bewertung der Gewebeentfernung des Zahnmarks in Wurzelkanälen extrahierter Zähne: eine Reihe von aufeinanderfolgenden Experimenten zur Methodenvalidierung

Zusammenfassung

Ziel: Eine neue Methode zur Bewertung der Debridement von Pulpa-Gewebe in den Wurzelkanälen extrahierter Zähne zu validieren, unter Verwendung eines Impregnationsprotokolls mit Kaliumtriiodid, einer radiokontrastierenden Lösung, bekannt als Lugol’s, kombiniert mit mikro-Computertomographie (Mikro-CT) Bildgebung.

Methodik: Der Einfluss von NaOCl auf die Radiopazität der Lugol’s Lösung wurde mithilfe einer zweifachen Verdünnungsreihe von Lugol in destilliertem Wasser und 5,25% NaOCl bewertet, die dann in transparente Schalen pipettiert und radiografiert wurden. Um den Einfluss von Lugol auf den proteolytischen Effekt von NaOCl zu überprüfen, wurde ein Auflösungsversuch mit frischem Rindfleisch durchgeführt. Zehn Scheiben wurden keiner Gewebeverarbeitung unterzogen, während zwanzig Scheiben 24 Stunden in Formaldehyd fixiert wurden. Danach wurden 10 von ihnen für weitere 24 Stunden in Lugol eingetaucht. Anschließend wurden alle Proben in NaOCl platziert und die benötigte Zeit für eine vollständige Gewebeauflösung aufgezeichnet. Für die letzten Experimente (histologische Validierung und Mikro-CT-Bewertung) wurden 8 extrahierte mandibuläre Prämolaren mit ehemals vitalen Pulpen in gepuffertem Formalin eingetaucht, in einem Mikro-CT-Gerät gescannt, bewertet, 7 Tage in Lugol eingetaucht und erneut gescannt. Dann wurden die Wurzelkanäle von 5 Zähnen präpariert und gescannt, und das Volumen des verbleibenden Pulpa-Gewebes identifiziert und quantifiziert, während 3 Zähne histologisch verarbeitet wurden. Dieselben Proben wurden einer histologischen Bewertung unterzogen, und die Bilder der histologischen Schnitte wurden mit den entsprechenden Mikro-CT-Bildern registriert, um zu überprüfen, ob das Pulpa-Gewebe in den histologischen Schnitten mit dem entsprechenden Gewebe in den mit Lugol imprägnierten Geweben übereinstimmte, die in den Mikro-CT-Schnitten identifiziert wurden.

Ergebnisse: Es gab keinen erkennbaren Effekt auf die Radiopazität, als NaOCl mit Lugolscher Lösung gemischt wurde. Die Gewebeverarbeitung hatte keinen Einfluss auf die Zeit, die für die vollständige Auflösung von frischem Rindfleisch erforderlich war. Die histologische Bewertung zeigte eine Korrelation zwischen Mikro-CT- und histologischen Bildern, die die Identifizierung von Lugol-imprägniertem Pulpa-Gewebe in Mikro-CT-Bildern bestätigte. Schlussfolgerungen Die radiokontrastierende Lugolsche Lösung wurde durch NaOCl nicht beeinflusst und störte nicht ihre Fähigkeit zur Auflösung von Weichgewebe. Das Imprägnierungsprotokoll mit Lugolscher Lösung ermöglichte die Visualisierung von Pulpa-Gewebe auf den Mikro-CT-Bildern und die Identifizierung von Pulpa-Resten nach chemisch-mechanischen Kanalverfahren.

Einleitung

Die konventionelle Analyse histologischer Schnitte und die Verwendung von Röntgen-Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) gelten als die Goldstandardmethoden zur Bewertung von Reinigungs- und Formungsverfahren während der Wurzelkanalaufbereitung. Während Mikro-CT es ermöglicht, die mineralisierten Gewebe des Wurzelkanals, die durch mechanische Vorbereitung entfernt wurden, zu identifizieren und zu quantifizieren, wird die Menge des verbleibenden (unmineralisierten) Pulpa-Gewebes normalerweise anhand histologischer Schnitte bewertet. Trotz der Nützlichkeit der Mikro-CT-Technologie war diese Methode daher auf die Bewertung von Veränderungen entlang der Kanalwände beschränkt, einschließlich Transport und der Schaffung von Aberrationen wie Zips und Perforationen. Aufgrund der Durchdringungskraft von Röntgenstrahlen bieten Mikro-CT-Techniken eine 3D-Dichtemappe von Proben und Geweben, die diese Strahlung stark absorbieren (Alfaro et al. 2015, Cunha et al. 2015). Sie ist jedoch ungeeignet für die Bildgebung von Weichgeweben wie der Zahnpulpa, da diese Gewebe Röntgenstrahlen nur in sehr begrenztem Maße absorbieren (Gignac & Kley 2014).

In jüngster Zeit wurde in zwei Studien ein korrelativer Ansatz unter Verwendung von Histologie als ergänzende Methode zur Mikro-CT-Bewertung eingesetzt, um verschiedene chemomechanische Protokolle in Wurzelkanälen zu evaluieren (Lacerda et al. 2017, Siqueira et al. 2018). Beide Studien zeigten histologisch das Vorhandensein von Resten von Pulpa-Gewebe, die an unberührte Kanalwände angeheftet waren, die zuvor durch Mikro-CT-Analysen identifiziert wurden. Obwohl dieser korrelative Ansatz unter Verwendung verschiedener Methoden die Zuordnung von Kausalmechanismen ermöglichen kann, erlaubt die histologische Analyse in der Regel nur die Beurteilung von wenigen Schnitten pro Wurzel, was sehr begrenzte Daten liefert und nicht mit der Menge an Informationen in den Hunderte von Querschnittsbildern übereinstimmt, die normalerweise durch das Mikro-CT-Scannen eines typischen Wurzelkanals erzeugt werden. Darüber hinaus ist die histologische Schnitttechnik ein zeitaufwändiges und kostspieliges Verfahren, das das Präparat zerstört.

Es ist offensichtlich wünschenswert, eine zuverlässige, nicht destruktive experimentelle Methode zu entwickeln, die in der Lage ist, gleichzeitig die Qualität und Quantität von weichen und harten Geweben in einem heterogenen Präparat wie dem menschlichen Zahn zu bewerten. In anderen Forschungsbereichen wurde diese Einschränkung überwunden, indem verschiedene Kontrastmittel wie Osmium, Gold, Bariumsulfat und iodhaltige Farbstoffe verwendet wurden (Metscher 2009a, b, Faulwetter et al. 2013, Pauwels et al. 2013). Insgesamt wurde nachgewiesen, dass eine wässrige Lösung von Lugolscher Jodlösung, auch als Jod-Kaliumiodid (I₂KI) bekannt, zu den effektivsten Mitteln gehört, um schnell eine Vielzahl von Weichgewebetypen zu differenzieren. Lugolsche Lösung ist eine einfache, kostengünstige, ungiftige und schnelle Färbeoption zur Kontrastverstärkung von Weichgeweben. Dennoch war ihre Verwendung auf anatomische Studien einer Vielzahl biologischer Präparate beschränkt, die eine breite Palette unterschiedlicher Jodkonzentrationen und Färbedauern verwendeten, abhängig von der Art des Gewebes (Heimel et al. 2019). Derzeit ist es trotz der Tatsache, dass die Lugol-Imprägnierung das am häufigsten verwendete Kontrastmittel in der anatomischen Studie von Weichgeweben ist, immer noch unklar, ob diese Lösung für die Mikro-CT-Bewertung von Pulpa-Gewebe nach der Wurzelkanalreinigung ex vivo geeignet wäre. Eines der grundlegenden Probleme bei der Verwendung von Lugol betrifft Natriumhypochlorit (NaOCl), das Hauptendodontikum, das verwendet wird, um nekrotisches Pulpa-Gewebe aufzulösen (Zehnder 2006), das mit Jod reagiert (Vogel 1978) und somit die Imprägnierung und Sichtbarkeit auf radiografischen Bildern beeinträchtigen könnte.

Die vorliegende Mitteilung berichtet über eine Reihe von kaskadierenden Experimenten, die darauf abzielen, das Potenzial zur Visualisierung von Zahnpulpa-Gewebe in Mikro-CT-Bildern unter Verwendung von Lugol als kontrastverstärkende Lösung einzuführen und zu erkunden. Die Kaskade von Experimenten hatte zum Ziel, das Imprägnierungsprotokoll und die kontrastverstärkte Mikro-CT (CE-CT)-Methode zu validieren und gleichzeitig die Vorteile und potenziellen Einschränkungen dieser neuartigen Methodik zu identifizieren. Die Kaskadenexperimente wurden entworfen, um:

• Das Potenzial von NaOCl zur Reduzierung des radiografischen Kontrasts, der mit Lugol verbunden ist (Radiopazitätstest), zu bewerten;
• Die Möglichkeit zu überprüfen, dass die Lugol-Lösung den proteolytischen Effekt von NaOCl beeinflusst (Test zur Auflösung von Weichgewebe);
• Die Fähigkeit der Lugol-Lösung zu bewerten, das Pulpagewebe ordnungsgemäß zu imprägnieren, durch korrelative Bildgebung von Lugol-verbessertem Mikro-CT und konventioneller Histologie (histologische Validierung);
• Das verbleibende Volumen des Lugol-imprägnierten Pulpagewebes zu messen (volumetrische Mikro-CT-Bewertung).

Materialien und Methoden

Einfluss von NaOCl auf die Radiopazität von Lugols Lösung

Lugols Lösung (I₂KI), die für alle Experimente verwendet wurde, hatte eine Konzentration von 5% I₂ und 10% KI. Um den Einfluss von NaOCl auf die Radiopazität zu bewerten, wurde eine 1:1 Verdünnungsreihe in destilliertem Wasser und 5,25% NaOCl (1,5 mL Gesamtvolumen) durchgeführt. Die reine Lösung und ihre Verdünnungen wurden in runde transparente Polystyrolschalen (Semadeni, Ostermundigen, Schweiz) mit einem Innendurchmesser von 23,4 mm bis zu einer Tiefe von 3,5 mm pipettiert. Die Radiopazität wurde mit einem standardisierten Aufbau bestimmt, wie zuvor beschrieben (Hertig et al. 2017). Kurz gesagt, elektronische Datensätze wurden mit einem festen Gerät (Trophy, Paris, Frankreich) bei 65 kV, 8 mA und 0,22 s mit einem Fokus-Film-Abstand von 25 cm und elektronischen Sensoren (Digora; Soredex, Tuusula, Finnland) erzeugt. Die Bilder wurden mit ImageJ (Bethesda, MD, USA) analysiert. Grauwerte wurden in jedem Bild gegen einen Aluminium-Stufenkeil normalisiert, mit einer individuellen Standardkurve für jedes Bild. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die relative Radiopazität von Lugols Lösung und ihren Verdünnungen wird als Aluminiumäquivalent (in mm) pro mm Lösung ausgedrückt.

Test zur Auflösung von Weichgewebe

Dreißig Scheiben frisches Rindfleisch wurden auf ein ähnliches Gewicht (2 mg) und Abmessungen (4 x 4 mm) mit einem chirurgischen Skalpell Nr. 15 angepasst. Zehn Scheiben wurden keiner Gewebeverarbeitung unterzogen, während die anderen 20 für 24 Stunden in Formaldehyd fixiert wurden. Danach wurden 10 der fixierten Scheiben weitere 24 Stunden in Lugol-Lösung eingetaucht. Anschließend wurden alle Proben einzeln in Flaschen mit 40 ml 5,25% NaOCl gegeben, und die gesamte Zeit, die für die vollständige Auflösung des Pulpagewebes erforderlich war (in Minuten), wurde aufgezeichnet. Alle Testverfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Diese Untersuchung wurde nicht als Tierstudie klassifiziert, da sie keinen Einfluss auf das prämortale Schicksal oder den Schlachtprozess der Tiere hatte. Eine vorläufige Analyse der Rohdaten zeigte die Einhaltung einer gaußschen Verteilung (Shapiro–Wilk-Test, P < 0,05). Die Daten wurden zwischen den Gruppen mit einer einseitigen ANOVA verglichen, gefolgt vom Tukey-HSD-Test. Der Alpha-Fehler wurde auf 5% festgelegt.

Micro-CT-Bewertung von Resten des Pulpa-Gewebes

Nach der Genehmigung durch die lokale Ethikkommission (Protokoll-Nr. 12127319.3.0000.5243) wurden acht nicht kariöse, einwurzelige mandibuläre Prämolaren und ein mandibulärer Molar mit vitalen Pulpen, die aus kieferorthopädischen Gründen extrahiert wurden, in 10% gepuffertem Formalin eingetaucht und bis zu 30 Tage bei 15 °C gelagert. Anschließend wurden die Zähne mit einem Mikro-CT-Gerät (SkyScan 1173; Bruker microCT, Kontich, Belgien) bei einer Pixelgröße von 14,37 µm gescannt, eingestellt auf 70 kV, 114 mA, 360°-Drehung um die vertikale Achse mit einem Drehschritt von 0,5°, Rahmenmittelwert von 5, unter Verwendung eines 1,0 mm dicken Aluminiumfilters. Die NRecon-Software v.1.7.16 (Bruker micro-CT) wurde verwendet, um die Mikro-CT-Projektionen in axiale Querschnitte zu rekonstruieren, unter Verwendung einer Ringartefaktkorrektur von 4, Kontrastgrenzen von 0,006 bis 0,05 und einer Strahlenhärtungskorrektur von 40%, was zu 800–900 Graustufenbildern pro Zahn vom Zement-Schmelz-Übergang bis zur Spitze führte. Um die Kanalmorphologie zu überprüfen, wurden die Querschnittsbilder mit einer automatischen Routine (De-Deus et al. 2020) in der FIJI/ImageJ-Software (Fiji v.1.51n; Madison, WI, USA) segmentiert, und das Seitenverhältnis des Wurzelkanals, definiert als das Verhältnis der größeren zu den kleineren Durchmessern, wurde in jeder Scheibe vom Orifice bis zum apikalen Foramen gemessen. Dann wurde das Kanalvolumen (in mm³) als das Volumen des binarisierten Wurzelkanals innerhalb des Interessengebiets berechnet.

Nach der konventionellen Präparation der Zugangshöhle wurde jeder Zahn 7 Tage lang in Lugol-Lösung eingetaucht und einer neuen Scanning- und Rekonstruktionsprozedur unter Verwendung der zuvor genannten Parameter unterzogen, um die Durchdringung des gesamten Pulpa-Gewebes durch die Kontrastlösung zu bewerten. Dieses Bilderset wurde mit dem ungefärbten Datensatz unter Verwendung des affinen Algorithmus, der in der 3D Slicer 4.6.0 Software (http://www.slicer.org) implementiert ist, ko-registeriert (Fedorov et al. 2012), und das Wurzel-Dentin des Zahns nach der Eintauchung wurde durch eine Boolesche Operation entfernt, um das Rauschen, das durch die Segmentierung des Pulpa-Gewebes erzeugt wurde, zu reduzieren. So wurde das mit Lugol-Lösung durchdrungene Pulpa-Gewebe beobachtet und quantifiziert (in mm³) durch den Segmentierungsprozess mit einem spezifischen Schwellenwert unter Verwendung des Object Counter-Tools, das in der FIJI/ImageJ-Software verfügbar ist. Danach wurden die Wurzelkanäle von 5 der 8 ausgewählten Prämolaren chemomechanisch präpariert, während die anderen 4 gesunden Zähne (3 Prämolaren und 1 Molaren) zur histologischen Schnittherstellung vorbereitet wurden, um das Vorhandensein von Pulpa-Gewebe-Resten zu bestätigen (Kontrollgruppe).

Wurzelkanalaufbereitung

Die Wurzelkanäle wurden bis zur Arbeitslänge mit dem Reciproc R25 Instrument (VDW GmbH, München, Deutschland) vorbereitet, das von einem VDW Silver Motor (VDW GmbH) im voreingestellten Programm ‘RECIPROC ALL’ betrieben wurde, wobei leichter apikaler Druck mit einer langsamen Ein- und Auswärtsbewegung von 3 mm Amplitude angewendet wurde. Nach Abschluss von drei Bewegungen wurde das Instrument aus dem Kanal entfernt und seine Flöten durch Einführen in einen mit Alkohol befeuchteten Schwamm gereinigt. Die Arbeitslänge wurde nach 3 Wellen der Instrumentierung erreicht. Die apikale Durchgängigkeit wurde während der Aufbereitungsverfahren mit einer Größe 15 K-Datei (Dentsply Sirona Endodontics, Ballaigues, Schweiz) durchgeführt. Die Spülung erfolgte mit insgesamt 12 ml 5,25% NaOCl, das mit einer 31-G NaviTip Doppelseitenportnadel (Ultradent Inc., South Jordan, UT, USA) in den Wurzelkanal eingebracht wurde, wobei die Nadel 1 mm vor der Arbeitslänge gehalten wurde. Nach der Wurzelkanalaufbereitung wurden die Proben erneut gescannt, rekonstruiert und mit den oben genannten Parametern ko-registeriert. Anschließend wurde das Volumen der mit Lugol’s Lösung imprägnierten Restgewebe des Zahnmarks berechnet (in mm³) und als Prozentwert basierend auf dem ursprünglichen Volumen des Zahnmarkgewebes quantifiziert.

Histologische Bewertung

Nach den oben beschriebenen experimentellen Verfahren wurden die Proben in einer Lösung aus 22,5 % (vol/vol) Ameisensäure und 10 % (wt/vol) Natriumcitrat über einen Zeitraum von 2–3 Wochen demineralisiert. Der Endpunkt wurde radiografisch überwacht. Die Proben wurden dann 24 Stunden in Leitungswasser gespült, dehydriert und für die routinemäßige histologische Untersuchung aufbereitet. Die Zähne wurden in Paraffinblöcke eingebettet, und serielle Querschnitte von 0,6 µm Dicke wurden alle 1 mm von der Zement-Schmelz-Grenze bis zur Spitze gewonnen, was zu 8 Schnitten pro Zahn führte. Die gewonnenen Schnitte wurden auf Glasscheiben montiert und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Histologische Bilder wurden mit einem vollständig motorisierten Lichtmikroskop Axioplan 2 Imaging (Carl Zeiss Vision, Hallbergmoos, Deutschland) visualisiert.

Abgleich der Lugol-imprägnierten Mikro-CT-Bilder und histologischen Schnitte

Die gewonnenen Mikro-CT-Schnitte, die das Lugol-imprägniertes Pulpa-Gewebe enthielten, wurden entlang der z-Achse unter Verwendung eines Referenz-Koordinatensystems, das auf einem landmarkenbasierten Registrierungsalgorithmus (Analyze-Software; Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA) basierte, inspiziert, um sie mit den Mikro-Radiographiebildern der histologischen Schnitte auszurichten. Nach der Auswahl der entsprechenden Bilder wurde eine dimensionale Standardisierungsanpassung durchgeführt, einschließlich automatischer Vergrößerung, Größenänderung und Zuschneiden, mittels eines computerassistierten Verfahrens. Dieser Verfahrensschritt ermöglichte es den Prüfern, die Wurzeln auf denselben Ebenen zuverlässig zu inspizieren und somit qualitativ zu überprüfen, ob das Pulpa-Gewebe im histologischen Schnitt mit seinem Gegenstück im Lugol-imprägnierten Mikro-CT-Schnitt übereinstimmte, was die Wirksamkeit des Imprägnationsprotokolls und der Scanparameter bestätigte. Zwei vorkalibrierte Prüfer verwendeten ein Proforma mit vordefinierten Kriterien, um den Grad der Übereinstimmung zwischen Lugol-imprägnierten und histologischen Bildern zu analysieren. Der Bildanalyseprozess wurde an einem 34-Zoll-Hochleistungscomputer-Monitor durchgeführt, mit der Möglichkeit, Bilder zu vergrößern (bis zu 10x) und den Farbmodus umzukehren. Um den analytischen Prozess zu validieren, wurden die Analysen zweimal in 10-tägigen Abständen wiederholt, um die Reproduzierbarkeit zu bewerten.

Ergebnisse

Einfluss von NaOCl auf die Radiopazität von Lugols Lösung

Reine Lugols Lösung hatte eine Radiopazität von 0,70 ± 0,09 mm Al mm^-1. Die Verdünnung in 5,25% NaOCl hatte einen ähnlichen Effekt auf die Radiopazität wie das Kontrollverfahren in Wasser, wobei die höheren Verdünnungen in NaOCl eine leicht höhere Radiopazität zeigten (Abb. 1), die auf dem Unterschied in der Radiopazität zwischen der reinen 5,25% NaOCl-Lösung und Wasser von 0,05 mm Al mm^-1 basiert. Es gab keinen erkennbaren Effekt auf die Radiopazität, der durch die chemische Wechselwirkung zwischen NaOCl und Lugols Lösung verursacht wurde, was durch die Aufhellung der braunen Farbe in Gegenwart von NaOCl sichtbar war.

Test zur Auflösung von Weichgewebe

Violin-Diagramme veranschaulichen die Mittelwerte, Minimal- und Maximalwerte sowie die Datenverteilung der Gewebeauflösung unter den Proben (Abb. 2). Die Gewebeverarbeitung in Formaldehyd und Lugol-Lösung hatte keinen Einfluss auf die für die Auflösung von frischem Rindfleisch benötigte Zeit (P > 0,05).

Histologische Validierung

Die Gesamtqualität des verwendeten Färbeprotokolls wird in Abbildung 3 veranschaulicht. Die korrelative Analyse zwischen Mikro-CT- und histologischen Bildern bestätigte die Identität des mit Lugol imprägnierten Pulpa-Gewebes in den Mikro-CT-Bildern. Die Ergebnisse der übereinstimmenden Mikro-CT- und histologischen Bilder sind in den Abbildungen 4 und 5 dargestellt, die die Qualität des Färbeprotokolls bestätigen.

Volumetrische Mikro-CT-Bewertung

Zusätzlich wurden die segmentierten Pulpareste nach der Wurzelkanalaufbereitung quantifiziert und als Prozentwert ausgedrückt. Das Volumen des instrumentierten Wurzelkanals und die nicht instrumentierten Kanalbereiche, die mit der Mikro-CT-Methode erfasst wurden, wurden ebenfalls quantifiziert (Tabelle 1) und in den Abbildungen 6 und 7 sowie im ergänzenden Video 1 dargestellt. Das Volumen des Wurzelkanals und das Seitenverhältnis beeinflussten direkt die Entfernung von Pulpa-Gewebe während der Instrumentierung. Zähne mit Seitenverhältnis-Werten von weniger als 3,5, dargestellt durch die grafische Kurve und hohe Volumina, waren mit kleineren Volumina von Pulparesten assoziiert.

Diskussion

Diese Mitteilung führt eine neuartige Färbemethode für Zahnpulpa-Gewebe im Kontext der Mikro-CT-Bewertung der Wurzelkanalreinigung ein, die offensichtliche vorteilhafte Anwendungen für zukünftige Forschungen in diesem Bereich bietet. Die vorgeschlagene nicht destruktive Methode ist in der Lage, hochauflösende Bilder und 3D-Informationen über das Pulpagewebe und das Dentin gleichzeitig bereitzustellen, wodurch die longitudinale und quantitative volumetrische Bewertung von Wurzelkanalreinigungs- und -formungsverfahren ermöglicht wird. Seit Gysi & Röse (1894) die ersten hochwertigen Photomikrographien veröffentlichten, die Details der vaskulären, lymphatischen und nervösen Elemente des Pulpa-Dentin-Komplexes eines mandibulären Molaren zeigten, und Kölliker (1852) die erste Beschreibung der Zahnpulpa lieferte, die von ihm als Pulpa dentis bezeichnet wurde, in seinem klassischen Buch über die feinen Strukturen der Gewebe und Organe des Körpers, haben viele Studien Zähne mit histologischen Methoden untersucht. Mit dieser Technik waren Hatton et al. (1928) die ersten, die zeigten, dass der Kanal nur oberflächlich gereinigt wurde und viel des Pulpagewebes nach der Vorbereitung mit rostfreien Stahlinstrumenten nicht entfernt wurde. Es war jedoch erst nach der Veröffentlichung einer wegweisenden Studie von Walton (1976), die die Menge des verbleibenden Pulpagewebes nach den Reinigungs- und Formungsverfahren bewertete, dass die paraffinbasierte histologische Schnitte die Standardmethode zur Bestimmung der Wirksamkeit von Reinigungsverfahren im Wurzelkanalraum wurden.

Bei intakten Zähnen mit vitalen Pulpen, die normalerweise als Kontrolle in histologischen Schnittstudien verwendet werden, ist das Pulpagewebe am gesamten Umfang des Wurzelkanals befestigt (De-Deus et al. 2010, 2011), während die Gewebereste in den experimentellen Gruppen bestätigen, welche Bereiche entlang der Kanalwände nicht mechanisch gereinigt wurden oder wo die Spülprotokolle ineffektiv waren. Da Pulpreste als Substrat für Bakterien dienen können und die Qualität der Wurzelfüllverfahren negativ beeinflussen könnten (Ricucci et al. 2009, Ricucci & Siqueira 2011), unterstützt dies theoretisch diese experimentelle Variable, verbleibendes Pulpagewebe, als akzeptierten Surrogat-Endpunkt für die Qualität der Reinigungsverfahren im Wurzelkanalraum. Die Prozesse und die daraus resultierende Arbeitsbelastung für die Probenvorbereitung, die das Schneiden, Färben, Bilden und die endgültige umfassende histologische Bewertung umfasst, bleibt jedoch eine mühsame und arbeitsintensive Technik. Insbesondere im Kontext der endodontischen Laborforschung ist die Entkalkung von mineralisierten Zahngeweben ein zeitaufwändiger und komplizierter Schritt, und es ist eine Herausforderung, hochwertige Proben zu erhalten, ohne das Pulpagewebe zu beschädigen. Dies wird noch wichtiger, da die histologischen Schnitte von entkalkten Hartgeweben im Allgemeinen dazu neigen, erhebliche Gewebeverzerrungen, Verarbeitungsprobleme und strukturelle Artefakte zu induzieren. Zum Beispiel tritt bei Knochengeweben eine Gewebeschrumpfung von bis zu 3% auf (Lane & Ráliš 1983, Henson et al. 1994), während die Dehydration von Weichgewebe eine Schrumpfung von bis zu 11% erzeugen kann (Rown et al. 2002). Daher ist es bemerkenswert, dass quantitative Mikroskopiedaten aus histologischen Schnitten von Geweben stammen, die vermutlich während der Probenvorbereitung geschrumpft sind, obwohl die nützlichen Erkenntnisse in der Literatur zu diesem Thema vorliegen. Darüber hinaus führen histologische Schnitttechniken unweigerlich zum Verlust von Proben, was longitudinale Experimente über die Zeit unmöglich macht. Daher kann die Histologie im Vergleich zu den volumetrischen und quantitativen Ansätzen, die durch nicht destruktive Bildgebungsverfahren erreicht werden (Tabelle 2), als archaische Methode betrachtet werden, obwohl sie bis heute das einzige verfügbare experimentelle Modell bleibt, das die gleichzeitige Bewertung sowohl mineralisierter Hart- als auch Weichgewebe von Zähnen auf ultrastruktureller Ebene ermöglicht und somit in der Lage ist, Licht auf dieses wichtige Forschungsgebiet zu werfen (De-Deus et al. 2008, 2010, 2011).

Mehrere Studien, die nicht-invasive Mikro-CT-Technologie verwenden, haben gezeigt, dass die Präparation der Wurzelkanalwände mit endodontischen Instrumenten, die entweder in rotierender oder reziproker Bewegung aktiviert werden, nicht ideal ist (Paqué et al. 2010, Paqué & Peters 2011, Versiani et al. 2013, De-Deus et al. 2015, Zuolo et al. 2018).

Die mechanische Präparation mit diesen Instrumenten ist begrenzt, da sie dazu neigen, nur die zentralen Aspekte der Wurzelkanäle zu präparieren, um eine runde Form zu schaffen, während die meisten der buccalen und lingualen Erweiterungen dieser komplexen Räume unberührt bleiben, selbst wenn seitliche Bewegungen versucht werden, wie zum Beispiel bei einer Bürstbewegung (Paqué et al. 2010, Paqué & Peters 2011, Versiani et al. 2013, De-Deus et al. 2015, Zuolo et al. 2018).

Obwohl Mikro-CT wertvolle und genaue Messungen bezüglich der Position und Menge des während der Kanalpräparation entfernten Dentins liefern kann, bietet es keine Informationen über das Pulpa-Gewebe oder mikrobielle Biofilme, die möglicherweise an den Wurzelkanalwänden haften bleiben, insbesondere in Bereichen, die nicht durch die mechanische Wirkung der Instrumente erreicht werden, wie Isthmus, Finnen, Anastomosen und Accessorikanäle (Versiani et al. 2013). Das bedeutet, dass Mikro-CT im Wesentlichen auf die Bewertung der Veränderungen der dentinalen Wände beschränkt ist, da Mikro-CT in seiner Essenz ungeeignet ist, Weichgewebe abzubilden, da sie für Röntgenstrahlen praktisch „transparent“ sind. Diese Einschränkung hängt mit der Unfähigkeit dieser auf Knochenforschung basierenden radiografischen Methode zusammen, die darauf ausgelegt ist, dichtere Elemente wie Calcium darzustellen, nicht-radiolucente Weichgewebe zu erkennen (Rüegsegger et al. 1996). Es gab jedoch bedeutende Fortschritte in der mikro-CT-basierten Forschung in anderen biomedizinischen Bereichen, einschließlich verschiedener Arten von Tisch-Scannern, der Erfassung von Phasen-Kontrastinformationen, schnelleren und effektiveren Scan-Akquisitionsprotokollen und Rekonstruktionsalgorithmen. Zusammengefasst können solche Entwicklungen genutzt werden, um weiche (nicht verkalkte) Gewebe abzubilden und ihre inhärente Einschränkung zu überwinden. Dazu kann eine spezifische Verbesserung der Visualisierung von Weichgewebe erreicht werden, indem radio-opake Kontrastmittel verwendet werden, um die Röntgenabsorption zu erreichen, die sogenannte kontrastverstärkte Mikro-CT-Technik (CE-CT). Kurz gesagt, CE-CT ist geeignet, heterogene Gewebe wie Zähne zu beurteilen.

Kontrastmittel bestehen aus spezifischen chemischen Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht, die in der Lage sind, sich natürlich an Weichgewebe zu binden, um auf effektive Weise 'Kontrast' zu erzeugen. Das in der vorliegenden Studie verwendete Kontrastmittel war das anorganische Lugolsche Jodlösung (I₂KI), das erstmals von Metscher (2009a) eingeführt wurde, der mehrere Protokolle zur Fixierung von Proben und das Färbungspotenzial verschiedener kommerziell erhältlicher Verbindungen für verschiedene Arten von Weichgewebe testete. Bis heute wurde nachgewiesen, dass Lugolsches Jod eine hohe Affinität zu Glykogen hat (Fennerty 1999) und epithelialen Zellen sowie Weichgewebe von Mäusen anvisiert (Degenhardt et al. 2010, Baverstock et al. 2013). Daher wurde das Potenzial von Lugolschem Jod zur Erzielung von Abbildungen des Pulpagewebes mit Mikro-CT in der aktuellen Studie getestet. Durch eine Reihe von Versuchen mit verschiedenen Imprägnierungsprotokollen ermöglichten Zähne mit konventionellen Zugangskavitäten, die 7 Tage in Lugolscher Lösung eingetaucht waren, die effektive Imprägnierung des Pulpagewebes (Abbildungen 3 und 7). Zwei Aspekte bezüglich der Verwendung der CE-CT-Methode zur longitudinalen Analyse von Pulparesten nach der Wurzelkanalspülung mit NaOCl-Lösung könnten jedoch von Interesse sein. Der erste Aspekt bezieht sich auf die chemische Reaktion von NaOCl mit dem Jod der Lugolschen Lösung. Trotz dieser Wechselwirkung reduzierte die Lugolsche Lösung nicht signifikant die proteolytische Fähigkeit von NaOCl unter den aktuellen Bedingungen. Die zweite Sorge war das Potenzial von NaOCl, den Grad des Kontrasts, der mit dem Lugol-imprägnierten Pulpagewebe verbunden ist, zu verringern. Der Radiopazitätstest ergab, dass die Lugolsche Lösung für die Imprägnierung von Pulpagewebe geeignet war, da NaOCl nicht mit ihrer Radiopazität interferierte. Zusammenfassend bestätigten diese Ergebnisse, dass die Lugolsche Lösung als Kontrastmittel zur Prüfung von Pulpagewebe als Substrat für die Analyse von NaOCl-basierten Spülprotokollen verwendet werden kann. Eine weitere Analyse konzentrierte sich auf die Validierung der Lugolschen Lösung zur ordnungsgemäßen Identifizierung von Pulpagewebe. Dazu wurde die paraffinbasierte histologische Schnitttechnik verwendet, um zu bestätigen, ob das mit Lugolscher Lösung imprägnierte Pulpagewebe auf Mikro-CT-Scans sichtbar war. Anschließend wurde ein experimenteller Ansatz entwickelt, um die histologischen Schnitte mit den entsprechenden Bildern aus den Mikro-CT-Stapeln zu vergleichen und typische Ausrichtungsprobleme in dieser Art von korrelativer Analyse zu überwinden. Die Ergebnisse bestätigten die korrekte Identifizierung von Pulpagewebe in den Lugol-imprägnierten Mikro-CT-Bildern und bewiesen somit die Qualität des Imprägnierungsprotokolls (Abbildungen 4 und 5).

Es ist bemerkenswert, dass insbesondere für endodontische Forschungen, die das verbleibende Pulpagewebe als Ergebnisparameter verwenden, der CE-CT-Ansatz den klaren Vorteil hat, sich nicht auf eine ultrastrukturelle detaillierte Bewertung des Weichgewebes zu konzentrieren. Stattdessen ermöglicht CE-CT eine einfache quantitative Bewertung des verbleibenden Pulpagewebes als Ganzes in longitudinalen (über die Zeit) Experimenten (Abbildungen 6 und 7). Aus qualitativer Sicht können Hunderte von Querschnitten, die pro Zahn durch CE-CT erzeugt werden, ein besseres Verständnis der engen Beziehung zwischen der inneren Anatomie der Wurzelkanäle und den mechanischen Form- und Spülprotokollen vermitteln. Dies liegt daran, dass CE-CT 3D-Hochauflösungsmodelle liefert, die lebensnahe Informationen über die Dimensionen, strukturelle Quantifizierung und anatomische Merkmale heterogener Gewebe, wie zum Beispiel Dentin und Pulpagewebe, enthalten. Gleichzeitig ermöglicht diese Methode die Bewertung der präoperativen Verteilung des Pulpagewebes im gesamten Kanalsystem vor den experimentellen Verfahren, selbst nach 7 Tagen ohne ein Fixierungsprotokoll. Dies ist ein wichtiger Punkt, da die Menge und der Standort des Pulpagewebes als Störfaktor wirken können, der das Ergebnis des Experiments beeinflusst. Auf diese Weise scheint die Anwendung der CE-CT-Methode bei Zähnen mit vitalen Pulpen gültig und reproduzierbar zu sein, da das Pulpagewebe im gesamten Wurzelkanalsystem in allen gesunden Zähnen verteilt war. Zukünftige Studien, die diese innovative Methode verwenden, sollten den Vergleich verschiedener Spüllösungen (inert vs. aktive Lösungen) über die Zeit und die Vorbereitungsprotokolle hinsichtlich der Auflösungs-/Entfernungseffizienz von Pulpagewebe aus Wurzelkanalsystemen einbeziehen. Weitere Verbesserungen dieser Methode würden es auch ermöglichen, sie in in vivo-Forschungen unter Verwendung von CBCT anzuwenden, zum Beispiel. Im Moment erfordert die gegenwärtige Methodik, dass das Kontrastmittel mindestens 7 Tage lang mit dem Pulpagewebe in Kontakt ist, und in einem in vivo-Ansatz wären auch prä- und postoperative tomografische Bildgebungen erforderlich, die eindeutig den akzeptablen ethischen Forschungsprinzipien entsprechen müssen. Definitiv sollte das gegenwärtige Protokoll in vivo unter Verwendung von CBCT validiert werden. Andererseits kann es sicher in vivo angewendet werden, indem nicht kariöse und nicht restaurierte Zähne mit vitalen Pulpen, die zur Extraktion vorgesehen sind, ohne prä- oder postoperative Scans verwendet werden. Zum Beispiel kann, nachdem der vitale Zustand der Pulpa durch konventionelle Tests bestätigt wurde, das chemomechanische Protokoll in situ angewendet und die Kontrastlösung in den Pulpenkanalraum injiziert werden, wobei die koronale Zugangshöhle wiederhergestellt wird, um sicherzustellen, dass die Lugol-Lösung im Wurzelkanalraum bleibt. Dann kann der Zahn extrahiert, gelagert und nach einer Woche durch Mikro-CT-Bildgebung ausgewertet werden.

Zusammenfassend konzentriert sich die aktuelle Studie darauf, vorläufige, aber originale Beweise zur Unterstützung nicht-destruktiver longitudinaler CE-CT-Studien unter Verwendung von verbleibendem Pulpa-Gewebe als Ergebnisparameter bereitzustellen. Es wurde gezeigt, dass CE-CT in einer einzigen Methode die Hauptvorteile der Mikro-CT-Bildgebungstechnologie (Bewertung mineralisierter Gewebe) und traditioneller histologischer Methoden (Bewertung nicht-mineralisierter Gewebe) kombiniert, um Verfahren zur Wurzelkanalreinigung zu untersuchen, wobei die Möglichkeit besteht, jene Kanalbereiche zu bewerten, zu identifizieren und zu messen, die weder von mechanischer Vorbereitung noch von Spülprotokollen betroffen sind. Erwähnenswert ist, dass CE-CT die unabhängige Untersuchung mechanischer Kanalvorbereitungen und Spülprotokolle oder den kombinierten synergetischen Effekt chemisch-mechanischer Verfahren ermöglicht.

Schlussfolgerungen

Die Lugol-Lösung ermöglichte die Visualisierung von Pulpa-Gewebe auf Mikro-CT-Bildern. Die Lugol-Lösung wurde von NaOCl in ihrer Radiopazität nicht beeinflusst und interferierte nicht mit der Auflösung der fixierten und gefärbten Weichgewebe. Praktisch ermöglicht die hier vorgestellte kontrastverstärkte Mikro-CT-Bildgebungstechnik mit Lugol-Lösung die unabhängige oder gemeinsame Bewertung der Wirkung der chemischen Auflösung und der mechanischen Entfernung von Pulpa-Gewebe durch Reinigungs- und Formungsverfahren, was sie zu einer äußerst nützlichen Technik in der laborbasierten endodontischen Forschung macht.

Autoren: G. De-Deus, F. G. Belladonna, D. M. Cavalcante, M. Simões-Carvalho, E. J. N. L. Silva, J. C. A. Carvalhal, R. Q. Zamolyi, R. T. Lopes, M. A. Versiani, P. M. H. Dummer und M. Zehnder

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