Kontrastverstärkte Mikro-CT zur Bewertung der Gewebedebridement des Zahnmarks in Wurzelkanälen extrahierter Zähne: Eine Reihe von aufeinanderfolgenden Experimenten zur Methodenvalidierung

Zusammenfassung

Ziel: Eine neue Methode zur Bewertung der Entfernung von Pulpa-Gewebe in den Wurzelkanälen extrahierter Zähne mithilfe eines Imprägnierungsprotokolls mit Kaliumtriiodid, einer radiokontrastierenden Lösung, bekannt als Lugol’s, kombiniert mit mikro-Computertomographie (Mikro-CT) Bildgebung zu validieren.

Methodik: Der Einfluss von NaOCl auf die Radiopazität der Lugol’s Lösung wurde mithilfe einer zweifachen Verdünnungsreihe von Lugol in destilliertem Wasser und 5,25% NaOCl bewertet, die dann in transparente Schalen pipettiert und radiografiert wurden. Um den Einfluss von Lugol auf den proteolytischen Effekt von NaOCl zu überprüfen, wurde ein Auflösungsversuch mit frischem Rindfleisch durchgeführt. Zehn Scheiben wurden keiner Gewebeverarbeitung unterzogen, während zwanzig Scheiben 24 Stunden in Formaldehyd fixiert wurden. Danach wurden 10 von ihnen für weitere 24 Stunden in Lugol eingetaucht. Anschließend wurden alle Proben in NaOCl platziert und die benötigte Zeit für eine vollständige Gewebeauflösung aufgezeichnet. Für die letzten Experimente (histologische Validierung und Mikro-CT-Bewertung) wurden 8 extrahierte mandibuläre Prämolaren mit ehemals vitalen Pulpen in gepuffertem Formalin eingetaucht, in einem Mikro-CT-Gerät gescannt, bewertet, 7 Tage in Lugol eingetaucht und erneut gescannt. Dann wurden die Wurzelkanäle von 5 Zähnen präpariert und gescannt, und das Volumen des verbleibenden Pulpa-Gewebes identifiziert und quantifiziert, während 3 Zähne histologisch verarbeitet wurden. Dieselben Proben wurden einer histologischen Bewertung unterzogen, und die Bilder der histologischen Schnitte wurden mit den entsprechenden Mikro-CT-Bildern registriert, um zu überprüfen, ob das Pulpa-Gewebe in den histologischen Schnitten mit dem entsprechenden Gewebe in den mit Lugol imprägnierten Geweben übereinstimmte, die in den Mikro-CT-Schnitten identifiziert wurden.

Ergebnisse: Es gab keinen erkennbaren Effekt auf die Radiopazität, als NaOCl mit Lugolscher Lösung gemischt wurde. Die Gewebeverarbeitung hatte keinen Einfluss auf die Zeit, die für die vollständige Auflösung von frischem Rindfleisch erforderlich war. Die histologische Bewertung zeigte eine Korrelation zwischen Mikro-CT- und histologischen Bildern, die die Identifizierung von Lugol-imprägniertem Pulpa-Gewebe in Mikro-CT-Bildern bestätigte.

Schlussfolgerungen: Die radiokontrastierende Lugolsche Lösung wurde von NaOCl nicht beeinflusst und störte nicht die Fähigkeit zur Auflösung von Weichgewebe. Das Imprägnierungsprotokoll mit Lugolscher Lösung ermöglichte die Visualisierung von Pulpagewebe auf den Mikro-CT-Bildern und die Identifizierung von Pulparesten nach chemisch-mechanischen Kanalverfahren.

Einleitung

Die konventionelle Analyse histologischer Schnitte und die Verwendung von Röntgen-Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) gelten als die Goldstandardmethoden zur Bewertung von Reinigungs- und Formungsverfahren während der Wurzelkanalaufbereitung. Während Mikro-CT es ermöglicht, die mineralisierten Gewebe des Wurzelkanals, die durch mechanische Aufbereitung entfernt wurden, zu identifizieren und zu quantifizieren, wird die Menge des verbleibenden (unmineralisierten) Pulpagewebes normalerweise anhand histologischer Schnitte bewertet. Trotz der Nützlichkeit der Mikro-CT-Technologie war diese Methode daher auf die Bewertung von Veränderungen entlang der Kanalwände beschränkt, einschließlich Transport und der Schaffung von Aberrationen wie Zips und Perforationen. Aufgrund der Durchdringungskraft von Röntgenstrahlen bieten Mikro-CT-Techniken eine 3D-Dichtematrix von Proben und Geweben, die diese Strahlung stark absorbieren (Alfaro et al. 2015, Cunha et al. 2015). Sie sind jedoch ungeeignet für die Bildgebung von Weichgeweben, wie der Zahnpulpa, da diese Gewebe Röntgenstrahlen nur in sehr begrenztem Maße absorbieren (Gignac & Kley 2014).

In jüngster Zeit wurde in zwei Studien ein korrelativer Ansatz unter Verwendung von Histologie als ergänzende Methode zur Mikro-CT-Bewertung eingesetzt, um verschiedene chemomechanische Protokolle in Wurzelkanälen zu evaluieren (Lacerda et al. 2017, Siqueira et al. 2018). Beide Studien zeigten histologisch das Vorhandensein von Resten von Pulpa-Gewebe, die an unberührte Kanalwände angeheftet waren, die zuvor durch Mikro-CT-Analysen identifiziert wurden. Obwohl dieser korrelative Ansatz unter Verwendung verschiedener Methoden die Zuordnung von Kausalmechanismen ermöglichen kann, erlaubt die histologische Analyse in der Regel nur die Bewertung von wenigen Schnitten pro Wurzel, was sehr begrenzte Daten liefert und nicht mit der Menge an Informationen in den Hunderten von Querschnittsbildern übereinstimmt, die normalerweise durch das Mikro-CT-Scannen eines typischen Wurzelkanals erzeugt werden. Darüber hinaus ist das histologische Schneiden ein zeitaufwändiges und teures Verfahren, das das Präparat zerstört.

Es ist offensichtlich wünschenswert, eine zuverlässige, nicht destruktive experimentelle Methode zu entwickeln, die in der Lage ist, die Qualität und Quantität von weichen und harten Geweben in einem heterogenen Präparat wie dem menschlichen Zahn gleichzeitig zu bewerten. In anderen Forschungsbereichen wurde diese Einschränkung überwunden, indem verschiedene Kontrastmittel wie Osmium, Gold, Barium-Sulfat und iodbasierte Farbstoffe verwendet wurden (Metscher 2009a, b, Faulwetter et al. 2013, Pauwels et al. 2013). Insgesamt wurde nachgewiesen, dass eine wässrige Lösung von Lugolscher Jodlösung, auch als Jod-Potassiumiodid (I₂KI) bezeichnet, zu den effektivsten Mitteln gehört, um schnell eine Vielzahl von Weichgewebetypen zu differenzieren. Lugols Lösung ist eine einfache, kostengünstige, ungiftige und schnelle Färbeoption zur Kontrastverstärkung von Weichgeweben. Dennoch war ihre Verwendung auf anatomische Studien einer Vielzahl biologischer Präparate beschränkt, bei denen ein breites Spektrum unterschiedlicher Jodkonzentrationen und Färbedauern verwendet wurde, abhängig von der Art des Gewebes (Heimel et al. 2019). Derzeit ist es trotz der Tatsache, dass die Lugol-Imprägnierung das am häufigsten verwendete Kontrastmittel in der anatomischen Studie von Weichgeweben ist, immer noch unklar, ob diese Lösung für die Mikro-CT-Bewertung von Pulpa-Gewebe nach der Wurzelkanalreinigung ex vivo geeignet wäre. Eines der grundlegenden Probleme bei der Verwendung von Lugol betrifft Natriumhypochlorit (NaOCl), das Hauptendodontikum, das verwendet wird, um nekrotisches Pulpa-Gewebe aufzulösen (Zehnder 2006), das mit Jod reagiert (Vogel 1978) und somit die Imprägnierung und Sichtbarkeit auf radiografischen Bildern beeinträchtigen könnte.

Die vorliegende Mitteilung berichtet über eine Reihe von kaskadierenden Experimenten, die darauf abzielen, das Potenzial zur Visualisierung von Zahnpulpa-Gewebe in Mikro-CT-Bildern unter Verwendung von Lugol als kontrastverstärkende Lösung einzuführen und zu erkunden. Die Kaskade von Experimenten hatte zum Ziel, das Imprägnierungsprotokoll und die kontrastverstärkte Mikro-CT (CE-CT)-Methode zu validieren und gleichzeitig die Vorteile und potenziellen Einschränkungen dieser neuartigen Methodik zu identifizieren. Die Kaskadexperimente wurden entworfen, um:

• Das Potenzial von NaOCl zu bewerten, den Grad des radiografischen Kontrasts, der mit Lugol verbunden ist, zu reduzieren (Radiopazitätstest);
• Die Möglichkeit zu überprüfen, dass die Lugol-Lösung den proteolytischen Effekt von NaOCl beeinflusst (Test zur Auflösung von Weichgewebe);
• Die Fähigkeit der Lugol-Lösung zu bewerten, das Pulpagewebe ordnungsgemäß zu imprägnieren, durch korrelative Bildgebung von Lugol-verstärktem Mikro-CT und konventioneller Histologie (histologische Validierung);
• Das verbleibende Volumen des Lugol-imprägnierten Pulpagewebes zu messen (volumetrische Mikro-CT-Bewertung).

Materialien und Methoden

Einfluss von NaOCl auf die Radiopazität der Lugol-Lösung

Die für alle Experimente verwendete Lugol-Lösung (I₂KI) hatte eine Konzentration von 5% I₂ und 10% KI. Um den Einfluss von NaOCl auf die Radiopazität zu bewerten, wurde eine 1:1 Verdünnungsreihe in destilliertem Wasser und 5,25% NaOCl (1,5 mL Gesamtvolumen) durchgeführt. Die reine Lösung und ihre Verdünnungen wurden in runde transparente Polystyrolschalen (Semadeni, Ostermundigen, Schweiz) mit einem Innendurchmesser von 23,4 mm bis zu einer Tiefe von 3,5 mm pipettiert. Die Radiopazität wurde mit einem standardisierten Setup bestimmt, wie zuvor beschrieben (Hertig et al. 2017). Kurz gesagt, elektronische Datensätze wurden mit einem festen Gerät (Trophy, Paris, Frankreich) bei 65 kV, 8 mA und 0,22 s mit einem Fokus-Film-Abstand von 25 cm und elektronischen Sensoren (Digora; Soredex, Tuusula, Finnland) erzeugt. Die Bilder wurden mit ImageJ (Bethesda, MD, USA) analysiert. Grauwerte wurden in jedem Bild gegen einen Aluminium-Stufenkeil normalisiert, mit einer individuellen Standardkurve für jedes Bild. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die relative Radiopazität der Lugol-Lösung und ihrer Verdünnungen wird als Aluminiumäquivalent (in mm) pro mm Lösung ausgedrückt.

Test zur Auflösung von Weichgewebe

Dreißig Scheiben frisches Rindfleisch wurden auf ein ähnliches Gewicht (2 mg) und Abmessungen (4 x 4 mm) mit einem chirurgischen Skalpell Nr. 15 angepasst. Zehn Scheiben wurden keiner Gewebeverarbeitung unterzogen, während die anderen 20 für 24 Stunden in Formaldehyd fixiert wurden. Danach wurden 10 der fixierten Scheiben für weitere 24 Stunden in Lugolscher Lösung eingetaucht. Anschließend wurden alle Proben einzeln in Flaschen mit 40 ml 5,25% NaOCl gegeben, und die gesamte Zeit, die für die vollständige Auflösung des Pulpagewebes benötigt wurde (in Min.), wurde aufgezeichnet. Alle Testverfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Diese Untersuchung wurde nicht als Tierversuch eingestuft, da sie keinen Einfluss auf das prämortale Schicksal oder den Schlachtprozess der Tiere hatte. Eine vorläufige Analyse der Rohdaten zeigte die Einhaltung einer gaußschen Verteilung (Shapiro-Wilk-Test, P < 0,05). Die Daten wurden zwischen den Gruppen mit einer einseitigen ANOVA verglichen, gefolgt vom Tukey-HSD-Test. Der Alpha-Fehler wurde auf 5% festgelegt.

Micro-CT-Bewertung von Resten des Pulpa-Gewebes

Nach der Genehmigung durch das lokale Ethikkomitee (Protokoll Nr. 12127319.3.0000.5243) wurden acht nicht kariöse, einwurzelige mandibuläre Prämolaren und ein mandibularer Molar mit vitalen Pulpen, die aus orthodontischen Gründen extrahiert wurden, in 10% gepuffertem Formalin eingetaucht und bis zu 30 Tage bei 15 °C gelagert. Anschließend wurden die Zähne mit einer Pixelgröße von 14,37 µm mit einem Mikro-CT-Gerät (SkyScan 1173; Bruker microCT, Kontich, Belgien) gescannt, das auf 70 kV, 114 mA, 360°-Drehung um die vertikale Achse mit einem Drehschritt von 0,5°, einem Rahmenmittelwert von 5 und einem 1,0 mm dicken Aluminiumfilter eingestellt war. Die NRecon v.1.7.16-Software (Bruker micro-CT) wurde verwendet, um die Mikro-CT-Projektionen in axiale Querschnitte zu rekonstruieren, wobei eine Ringartefaktkorrektur von 4, Kontrastgrenzen von 0,006 bis 0,05 und eine Strahlenhärtungskorrektur von 40% verwendet wurden, was zu 800–900 Graustufenbildern pro Zahn vom Zement-Schmelz-Übergang bis zur Spitze führte. Um die Kanalmorphologie zu überprüfen, wurden die Querschnittsbilder mithilfe einer automatischen Routine (De-Deus et al. 2020) in der FIJI/ImageJ-Software (Fiji v.1.51n; Madison, WI, USA) segmentiert, und das Seitenverhältnis des Wurzelkanals, definiert als das Verhältnis der größeren zu den kleineren Durchmessern, wurde in jeder Scheibe vom Orifice bis zum apikalen Foramen gemessen. Dann wurde das Kanalvolumen (in mm³) als das Volumen des binarisierten Wurzelkanals innerhalb des Interessengebiets berechnet.

Nach der konventionellen Präparation der Zugangshöhle wurde jeder Zahn 7 Tage lang in Lugol-Lösung eingetaucht und anschließend einem neuen Scan- und Rekonstruktionsverfahren unterzogen, wobei die zuvor genannten Parameter verwendet wurden, um die Durchdringung des gesamten Pulpa-Gewebes durch die Kontrastlösung zu bewerten. Dieses Bilderset wurde mit dem ungefärbten Datensatz unter Verwendung des affinen Algorithmus, der in der 3D Slicer 4.6.0-Software (http://www.slicer.org) implementiert ist (Fedorov et al. 2012), ko-registeriert, und das Wurzel-Dentin des Zahns nach der Eintauchung wurde durch eine Boolesche Operation entfernt, um das durch die Segmentierung des Pulpa-Gewebes erzeugte Rauschen zu reduzieren. Somit wurde das mit Lugol-Lösung durchtränkte Pulpa-Gewebe beobachtet und quantifiziert (in mm³) durch den Segmentierungsprozess mit einem spezifischen Schwellenwert unter Verwendung des Object Counter-Tools, das in der FIJI/ImageJ-Software verfügbar ist. Danach wurden die Wurzelkanäle von 5 der 8 ausgewählten Prämolaren chemomechanisch präpariert, während die anderen 4 gesunden Zähne (3 Prämolaren und 1 Molaren) für die histologische Schnitte vorbereitet wurden, um das Vorhandensein von Pulpa-Gewebe-Resten zu bestätigen (Kontrollgruppe).

Wurzelkanalaufbereitung

Die Wurzelkanäle wurden bis zur Arbeitslänge mit dem Reciproc R25 Instrument (VDW GmbH, München, Deutschland) vorbereitet, das von einem VDW Silver Motor (VDW GmbH) im voreingestellten Programm ‘RECIPROC ALL’ betrieben wurde, wobei leichter apikaler Druck mit einer langsamen Ein- und Ausbewegung von 3 mm Amplitude angewendet wurde. Nach Abschluss von drei Bewegungen wurde das Instrument aus dem Kanal entfernt und seine Flöten durch Einführen in einen mit Alkohol befeuchteten Schwamm gereinigt. Die Arbeitslänge wurde nach 3 Wellen der Instrumentierung erreicht. Die apikale Durchgängigkeit wurde während der Aufbereitungsverfahren mit einer Größe 15 K-Datei (Dentsply Sirona Endodontics, Ballaigues, Schweiz) durchgeführt. Die Spülung erfolgte mit insgesamt 12 ml 5,25% NaOCl, das mit einer 31-G NaviTip-Doppelseitenportnadel (Ultradent Inc., South Jordan, UT, USA) in den Wurzelkanal eingebracht wurde, wobei die Nadel bis zu 1 mm vor der Arbeitslänge während der Aufbereitungsverfahren eingeführt wurde. Nach der Wurzelkanalaufbereitung wurden die Proben erneut gescannt, rekonstruiert und mit den oben genannten Parametern ko-registeriert. Anschließend wurde das Volumen der mit Lugol’s Lösung imprägnierten Restgewebe (in mm³) berechnet und als Prozentwert basierend auf dem ursprünglichen Volumen des Pulpagewebes quantifiziert.

Histologische Bewertung

Nach den oben beschriebenen experimentellen Verfahren wurden die Proben in einer Lösung aus 22,5 % (vol/vol) Ameisensäure und 10 % (wt/vol) Natriumcitrat über einen Zeitraum von 2–3 Wochen demineralisiert. Der Endpunkt wurde radiografisch überwacht. Die Proben wurden dann 24 Stunden in Leitungswasser gespült, dehydriert und für die routinemäßige histologische Untersuchung aufbereitet. Die Zähne wurden in Paraffinblöcke eingebettet, und es wurden serielle Querschnitte mit einer Dicke von 0,6 µm alle 1 mm vom Zement-Schmelz-Übergang bis zur Wurzelspitze angefertigt, was zu 8 Schnitten pro Zahn führte. Die gewonnenen Schnitte wurden auf Glasscheiben montiert und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Histologische Bilder wurden mit einem vollständig motorisierten Lichtmikroskop Axioplan 2 Imaging (Carl Zeiss Vision, Hallbergmoos, Deutschland) visualisiert.

Abgleich der Lugol-imprägnierten Mikro-CT-Bilder und histologischen Schnitte

Die gewonnenen Mikro-CT-Schnitte, die das Lugol-imprägniertes Pulpa-Gewebe enthielten, wurden entlang der z-Achse unter Verwendung eines Referenz-Koordinatensystems, das auf einem landmarkenbasierten Registrierungsalgorithmus (Analyze-Software; Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA) basierte, inspiziert, um sie mit den Mikro-Radiographiebildern der histologischen Schnitte auszurichten. Nach der Auswahl der entsprechenden Bilder wurde eine dimensionale Standardisierungsanpassung durchgeführt, einschließlich automatischer Vergrößerung, Größenänderung und Zuschnitt, mittels eines computerunterstützten Verfahrens. Dieser Verfahrensschritt ermöglichte es den Prüfern, die Wurzeln auf denselben Ebenen zuverlässig zu inspizieren und somit qualitativ zu überprüfen, ob das Pulpa-Gewebe im histologischen Schnitt mit seinem Gegenstück im Lugol-imprägnierten Mikro-CT-Schnitt übereinstimmte, was die Wirksamkeit des Imprägnationsprotokolls und der Scanparameter bestätigte. Zwei vorkalibrierte Prüfer verwendeten ein Proforma mit vordefinierten Kriterien, um den Grad der Übereinstimmung zwischen Lugol-imprägnierten und histologischen Bildern zu analysieren. Das Bildanalyseverfahren wurde an einem 34-Zoll-Hochleistungscomputer-Monitor durchgeführt, mit der Möglichkeit, Bilder zu vergrößern (bis zu 109) und den Farbmodus umzukehren. Um den analytischen Prozess zu validieren, wurden die Analysen zweimal in 10-tägigen Abständen wiederholt, um die Reproduzierbarkeit zu bewerten.

Ergebnisse

Einfluss von NaOCl auf die Radiopazität der Lugol-Lösung

Die reine Lugol-Lösung hatte eine Radiopazität von 0,70 ± 0,09 mm Al mm^—1. Die Verdünnung in 5,25% NaOCl hatte einen ähnlichen Effekt auf die Radiopazität wie das Kontrollverfahren in Wasser, wobei die höheren Verdünnungen in NaOCl eine leicht höhere Radiopazität zeigten (Abb. 1), die auf dem Unterschied in der Radiopazität zwischen der reinen 5,25% NaOCl-Lösung und Wasser von 0,05 mm Al mm^—1 basiert. Es gab keinen erkennbaren Effekt auf die Radiopazität, der durch die chemische Wechselwirkung zwischen NaOCl und der Lugol-Lösung verursacht wurde, was durch die Aufhellung der braunen Farbe in Anwesenheit von NaOCl sichtbar war.

Test zur Auflösung von Weichgewebe

Violin-Plots veranschaulichen die Mittelwerte, Minimal- und Maximalwerte sowie die Datenverteilung der Gewebeauflösung unter den Proben (Abb. 2). Die Gewebeverarbeitung in Formaldehyd und Lugol-Lösung hatte keinen Einfluss auf die für die Auflösung von frischem Rindfleisch benötigte Zeit (P > 0,05).

Histologische Validierung

Die Gesamtqualität des verwendeten Färbeprotokolls wird in Abbildung 3 veranschaulicht. Die korrelative Analyse zwischen Mikro-CT- und histologischen Bildern bestätigte die Identität des Lugol-imprägnierten Pulpa-Gewebes in den Mikro-CT-Bildern. Die Ergebnisse der übereinstimmenden Mikro-CT- und histologischen Bilder sind in den Abbildungen 4 und 5 dargestellt, die die Qualität des Färbeprotokolls bestätigen.

Volumetrische Mikro-CT-Bewertung

Zusätzlich wurden die segmentierten Pulpareste nach der Wurzelkanalaufbereitung quantifiziert und als Prozentwert ausgedrückt. Das Volumen des instrumentierten Wurzelkanals und die nicht instrumentierten Kanalbereiche, die durch die Mikro-CT-Methode erfasst wurden, wurden ebenfalls quantifiziert (Tabelle 1) und in den Abbildungen 6 und 7 sowie im ergänzenden Video 1 veranschaulicht. Das Volumen des Wurzelkanals und das Seitenverhältnis beeinflussten direkt die Entfernung von Pulpa-Gewebe während der Instrumentierung. Zähne mit Seitenverhältnis-Werten von weniger als 3,5, dargestellt durch die grafische Kurve und hohe Volumina, waren mit kleineren Volumina von Pulparesten assoziiert.

Diskussion

Diese Mitteilung stellt eine neuartige Färbemethode für Zahnpulpa-Gewebe im Kontext der Mikro-CT-Bewertung der Wurzelkanalreinigung vor, die offensichtliche Vorteile für zukünftige Forschungen auf diesem Gebiet bietet. Die vorgeschlagene nicht-invasive Methode ist in der Lage, hochauflösende Bilder und 3D-Informationen über Zahnpulpa und Dentin gleichzeitig bereitzustellen, wodurch die longitudinale und quantitative volumetrische Bewertung von Wurzelkanalreinigungs- und Formungsverfahren ermöglicht wird. Seit Gysi & Röse (1894) die ersten hochwertigen Photomikrographien veröffentlichten, die Details der vaskulären, lymphatischen und nervösen Elemente des Pulpa-Dentin-Komplexes eines mandibulären Molaren zeigten, und Kölliker (1852) die erste Beschreibung der Zahnpulpa, die er als Pulpa dentis bezeichnete, in seinem klassischen Buch über die feinen Strukturen der Gewebe und Organe des Körpers lieferte, haben viele Studien Zähne mit histologischen Methoden untersucht. Mit dieser Technik waren Hatton et al. (1928) die ersten, die nachwiesen, dass der Kanal nur oberflächlich gereinigt wurde und viel des Zahnpulpa-Gewebes nach der Vorbereitung mit Edelstahlinstrumenten nicht entfernt wurde. Es war jedoch erst nach der Veröffentlichung einer wegweisenden Studie von Walton (1976), die die Menge des verbleibenden Zahnpulpa-Gewebes nach den Reinigungs- und Formungsverfahren bewertete, dass die paraffinbasierte histologische Schnitttechnik zur Standardmethode wurde, um die Wirksamkeit der Reinigungsverfahren im Wurzelkanalraum zu bestimmen.

Bei intakten Zähnen mit vitalen Pulpen, die normalerweise als Kontrolle in histologischen Schnittstudien verwendet werden, ist das Pulpagewebe am gesamten Umfang des Wurzelkanals befestigt (De-Deus et al. 2010, 2011), während die Gewebereste in den experimentellen Gruppen bestätigen, welche Bereiche entlang der Kanalwände nicht mechanisch gereinigt wurden oder wo die Spülprotokolle ineffektiv waren. Da Pulpreste als Substrat für Bakterien dienen können und die Qualität der Wurzelfüllverfahren negativ beeinflussen könnten (Ricucci et al. 2009, Ricucci & Siqueira 2011), unterstützt dies theoretisch diese experimentelle Variable, verbleibendes Pulpagewebe, als akzeptierten Surrogat-Endpunkt für die Qualität der Reinigungsverfahren im Wurzelkanalraum. Die Prozesse und die resultierende Arbeitsbelastung für die Probenvorbereitung, die Schneiden, Färben, Bildgebung und die endgültige umfassende histologische Bewertung umfasst, bleibt jedoch eine umständliche und arbeitsintensive Technik. Insbesondere im Kontext der endodontischen Laborforschung ist die Entkalkung von mineralisierten Zahngeweben ein zeitaufwändiger und komplizierter Schritt, und es ist eine Herausforderung, hochwertige Proben zu erhalten, ohne das Pulpagewebe zu beschädigen. Dies wird umso wichtiger, da die histologischen Schnitte von entkalkten Hartgeweben im Allgemeinen dazu neigen, erhebliche Gewebeverzerrungen, Verarbeitungsfehler und strukturelle Artefakte zu induzieren. Zum Beispiel tritt bei Knochengeweben eine Gewebeschrumpfung von bis zu 3% auf (Lane & Ráliš 1983, Henson et al. 1994), während die Dehydrierung von Weichgewebe eine Schrumpfung von bis zu 11% verursachen kann (Rown et al. 2002). Daher ist es bemerkenswert, dass quantitative Mikroskopiedaten aus histologischen Schnitten von Geweben stammen, die vermutlich während der Probenvorbereitung geschrumpft sind, obwohl in der Literatur nützliche Erkenntnisse zu diesem Thema verfügbar sind. Darüber hinaus führen histologische Schnitttechniken unweigerlich zum Verlust von Proben, was longitudinale Experimente über die Zeit unmöglich macht. Daher kann Histologie im Vergleich zu dem volumetrischen und quantitativen Ansatz, der durch nicht zerstörende Bildgebungsverfahren erreicht wird (Tabelle 2), als archaische Methode betrachtet werden, obwohl sie bis heute das einzige verfügbare experimentelle Modell bleibt, das die gleichzeitige Bewertung sowohl mineralisierter harter als auch weicher Gewebe von Zähnen auf ultrastruktureller Ebene ermöglicht und somit in der Lage ist, Licht auf dieses wichtige Forschungsgebiet zu werfen (De-Deus et al. 2008, 2010, 2011).

Mehrere Studien, die nicht-invasive Mikro-CT-Technologie verwenden, haben gezeigt, dass die Präparation der Wurzelkanalwände mit endodontischen Instrumenten, die entweder in rotierender oder reziproker Bewegung aktiviert werden, nicht ideal ist (Paqué et al. 2010, Paqué & Peters 2011, Versiani et al. 2013, De-Deus et al. 2015, Zuolo et al. 2018). Die mechanische Präparation mit diesen Instrumenten ist begrenzt, da sie dazu neigen, nur die zentralen Aspekte der Wurzelkanäle zu präparieren, um eine runde Form zu schaffen, während die meisten der buccalen und lingualen Erweiterungen dieser komplexen Räume unberührt bleiben, selbst wenn seitliche Bewegungen versucht werden, wie zum Beispiel bei einer Bürstbewegung (Paqué et al. 2010, Paqué & Peters 2011, Versiani et al. 2013, De-Deus et al. 2015, Zuolo et al. 2018). Obwohl Mikro-CT wertvolle und genaue Messungen bezüglich der Position und Menge des während der Kanalpräparation entfernten Dentins liefern kann, bietet es keine Informationen über das Pulpagewebe oder mikrobielle Biofilme, die möglicherweise an den Wurzelkanalwänden haften bleiben, insbesondere in Bereichen, die nicht durch die mechanische Aktion der Instrumente erreicht werden, wie Isthmus, Finnen, Anastomosen und Accessorikanäle (Versiani et al. 2013). Das bedeutet, dass Mikro-CT im Wesentlichen auf die Bewertung der Veränderungen der dentinalen Wände beschränkt ist, da Mikro-CT im Grunde genommen ungeeignet ist, Weichgewebe abzubilden, da sie für Röntgenstrahlen praktisch „transparent“ sind. Diese Einschränkung hängt mit der Unfähigkeit dieser auf Knochenforschung basierenden radiografischen Methode zusammen, die darauf ausgelegt ist, dichtere Elemente wie Calcium darzustellen, nicht-radiolucente Weichgewebe zu erkennen (Rüegsegger et al. 1996). Es gab jedoch bedeutende Fortschritte in der mikro-CT-basierten Forschung in anderen biomedizinischen Bereichen, einschließlich verschiedener Arten von Tisch-Scannern, der Erfassung von Phasenkontrastinformationen, schnelleren und effektiveren Scan-Akquisitionsprotokollen und Rekonstruktionsalgorithmen. Zusammengefasst können solche Entwicklungen genutzt werden, um weiche (nicht verkalkte) Gewebe abzubilden und so die inhärente Einschränkung zu überwinden. Dazu kann eine spezifische Verbesserung der Visualisierung von Weichgewebe erreicht werden, indem radioopake Kontrastmittel verwendet werden, um die Röntgenabsorption zu erreichen, die sogenannte kontrastverstärkte Mikro-CT-Technik (CE-CT). Kurz gesagt, CE-CT eignet sich zur Beurteilung heterogener Gewebe wie Zähne.

Kontrastmittel bestehen aus spezifischen chemischen Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht, die in der Lage sind, sich auf natürliche Weise an Weichgewebe zu binden, um auf effektive Weise 'Kontrast' zu erzeugen. Das in der vorliegenden Studie verwendete Kontrastmittel war das anorganische Lugol'sche Jod (I₂KI), das erstmals von Metscher (2009a) eingeführt wurde, der mehrere Protokolle zur Fixierung von Proben und das Färbungspotenzial verschiedener kommerziell erhältlicher Verbindungen für eine Reihe von Arten von Weichgewebe testete. Bis heute wurde nachgewiesen, dass Lugol'sches Jod eine hohe Affinität zu Glykogen hat (Fennerty 1999) und epithelialen Zellen sowie Weichgewebe von Mäusen anvisiert (Degenhardt et al. 2010, Baverstock et al. 2013). Daher wurde das Potenzial von Lugol'schem Jod zur Erzielung von Abbildungen von Pulpa-Gewebe mit Mikro-CT in der aktuellen Studie getestet. Durch eine Reihe von Versuchen mit verschiedenen Imprägnierungsprotokollen ermöglichten Zähne mit konventionellen Zugangskavitäten, die 7 Tage in Lugol'scher Lösung eingetaucht waren, die effektive Imprägnierung von Pulpa-Gewebe (Abbildungen 3 und 7). Zwei Aspekte bezüglich der Verwendung der CE-CT-Methode zur longitudinalen Analyse von Pulpa-Resten nach der Wurzelkanalspülung mit NaOCl-Lösung könnten jedoch von Bedeutung sein. Der erste Aspekt bezieht sich auf die chemische Reaktion von NaOCl mit dem Jod der Lugol'schen Lösung. Trotz dieser Wechselwirkung reduzierte die Lugol'sche Lösung nicht signifikant die proteolytische Fähigkeit von NaOCl unter den aktuellen Bedingungen. Die zweite Sorge war das Potenzial von NaOCl, den Grad des Kontrasts zu verringern, der mit dem Lugol-imprägnierten Pulpa-Gewebe verbunden ist. Der Radiopazitätstest ergab, dass die Lugol'sche Lösung für die Imprägnierung von Pulpa-Gewebe geeignet war, da NaOCl nicht mit ihrer Radiopazität interferierte. Zusammengenommen bestätigten diese Ergebnisse, dass die Lugol'sche Lösung als Kontrastmittel zur Prüfung von Pulpa-Gewebe als Substrat für die Analyse von NaOCl-basierten Spülprotokollen verwendet werden kann. Eine weitere Analyse konzentrierte sich auf die Validierung der Lugol'schen Lösung zur ordnungsgemäßen Identifizierung von Pulpa-Gewebe. Dazu wurde die paraffinbasierte histologische Schnittechnik verwendet, um zu bestätigen, ob das mit Lugol'scher Lösung imprägnierte Pulpa-Gewebe auf Mikro-CT-Scans sichtbar war. Ein experimenteller Ansatz wurde dann entwickelt, um die histologischen Schnitte mit den entsprechenden Bildern aus den Mikro-CT-Stapeln zu vergleichen und typische Ausrichtungsprobleme in dieser Art von korrelativer Analyse zu überwinden. Die Ergebnisse bestätigten die korrekte Identifizierung von Pulpa-Gewebe in den Lugol-imprägnierten Mikro-CT-Bildern und bewiesen somit die Qualität des Imprägnierungsprotokolls (Abbildungen 4 und 5).

Es ist bemerkenswert, dass insbesondere für endodontische Forschungen, die das verbleibende Pulpa-Gewebe als Ergebnisparameter verwenden, der CE-CT-Ansatz den klaren Vorteil hat, sich nicht auf eine ultrastrukturelle detaillierte Bewertung des Weichgewebes zu konzentrieren. Stattdessen ermöglicht CE-CT eine einfache quantitative Bewertung des verbleibenden Pulpa-Gewebes als Ganzes in longitudinalen (über die Zeit) Experimenten (Abbildungen 6 und 7). Aus qualitativer Sicht können Hunderte von Querschnitten, die pro Zahn durch CE-CT erzeugt werden, ein besseres Verständnis der engen Beziehung zwischen der inneren Anatomie der Wurzelkanäle und mechanischen Formungs- und Spülprotokollen vermitteln. Dies liegt daran, dass CE-CT 3D-Hochauflösungsmodelle liefert, die lebensnahe Informationen über die Dimensionen, strukturelle Quantifizierung und anatomische Merkmale heterogener Gewebe, wie zum Beispiel Dentin und Pulpa-Gewebe, enthalten. Gleichzeitig ermöglicht diese Methode die Bewertung der präoperativen Verteilung des Pulpa-Gewebes im gesamten Kanalsystem vor den experimentellen Verfahren, selbst nach 7 Tagen ohne ein Fixierungsprotokoll. Dies ist ein wichtiger Punkt, da die Menge und der Standort des Pulpa-Gewebes als Störfaktor wirken können, der das Ergebnis des Experiments beeinflusst. Auf diese Weise scheint die Verwendung der CE-CT-Methode bei Zähnen mit vitalen Pulpen gültig und reproduzierbar zu sein, da das Pulpa-Gewebe im gesamten Wurzelkanalsystem in allen gesunden Zähnen verteilt war. Zukünftige Studien, die diese innovative Methode verwenden, sollten den Vergleich verschiedener Spüllösungen (inert vs. aktive Lösungen) über die Zeit und die Vorbereitungsprotokolle hinsichtlich der Lösungs-/Entfernungseffizienz von Pulpa-Gewebe aus Wurzelkanalsystemen einbeziehen. Weitere Verbesserungen dieser Methode würden es auch ermöglichen, sie in in vivo-Forschungen unter Verwendung von CBCT anzuwenden, zum Beispiel. Im Moment erfordert die gegenwärtige Methodik, dass das Kontrastmittel mindestens 7 Tage lang mit dem Pulpa-Gewebe in Kontakt ist, und in einem in vivo-Ansatz würde es auch prä- und postoperative tomographische Bildgebung erfordern, die eindeutig den akzeptablen ethischen Forschungsprinzipien entsprechen muss. Definitiv sollte das gegenwärtige Protokoll in vivo unter Verwendung von CBCT validiert werden. Andererseits kann es sicher in vivo angewendet werden, indem nicht kariöse und nicht restaurierte Zähne mit vitalen Pulpen, die zur Extraktion vorgesehen sind, ohne prä- oder postoperative Scans verwendet werden. Zum Beispiel kann nach Bestätigung des vitalen Zustands der Pulpa durch konventionelle Tests das chemomechanische Protokoll in situ angewendet und die Kontrastlösung in den Pulpa-Kanalraum injiziert werden, wobei die koronale Zugangshöhle wiederhergestellt wird, um sicherzustellen, dass die Lugol-Lösung im Wurzelkanalraum bleibt. Dann kann der Zahn extrahiert, gelagert und nach einer Woche durch Mikro-CT-Bildgebung ausgewertet werden.

Zusammenfassend konzentriert sich die aktuelle Studie darauf, vorläufige, aber originale Beweise zur Unterstützung von nicht destruktiven longitudinalen CE-CT-Studien unter Verwendung von verbleibendem Pulpa-Gewebe als Ergebnisparameter bereitzustellen. Es wurde gezeigt, dass CE-CT in einer einzigen Methode die Hauptvorteile der Mikro-CT-Bildgebungstechnologie (Bewertung mineralisierter Gewebe) und traditioneller histologischer Methoden (Bewertung nicht mineralisierter Gewebe) kombiniert, um Verfahren zur Wurzelkanalreinigung zu untersuchen, wobei die Möglichkeit besteht, die Bereiche des Kanals zu bewerten, zu identifizieren und zu messen, die weder von mechanischer Vorbereitung noch von Spülprotokollen betroffen sind. Erwähnenswert ist, dass CE-CT die unabhängige Untersuchung von mechanischen Kanalvorbereitungen und Spülprotokollen oder den kombinierten synergetischen Effekt chemisch-mechanischer Verfahren ermöglicht.

Schlussfolgerungen

Die Lugol-Lösung ermöglichte die Visualisierung von Pulpa-Gewebe auf Mikro-CT-Bildern. Die Lugol-Lösung wurde von NaOCl in ihrer Radiopazität nicht beeinflusst und interferierte nicht mit der Auflösung der fixierten und gefärbten Weichgewebe. Praktisch ermöglicht die hier vorgestellte kontrastverstärkte Mikro-CT-Bildgebungstechnik mit Lugol’s Lösung die unabhängige oder gemeinsame Bewertung der Wirkung der chemischen Auflösung und der mechanischen Entfernung von Pulpa-Gewebe durch Reinigungs- und Formungsverfahren, was sie zu einer äußerst nützlichen Technik in der laborbasierten endodontischen Forschung macht.

Autoren: G. De-Deus, F. G. Belladonna, D. M. Cavalcante, M. Simões-Carvalho, E. J. N. L. Silva, J. C. A. Carvalhal, R. Q. Zamolyi, R. T. Lopes, M. A. Versiani, P. M. H. Dummer, M. Zehnder

Referenzen:

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